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实验方案

支气管哮喘小鼠气道反应性无创检测方法的建立

支气管哮喘小鼠气道反应性无创检测方法的建立


李斌恺 赖克方 洪燕华 王法霞 陈如冲 林少建 钟南山

【摘要】 目的 目前国内对支气管哮喘 (简称哮喘) 小鼠的评价多数仅立足于气道炎性指标,不能完全反映哮喘的病理生理特征。 无创法检测时小鼠不必麻醉,而且每次可以同时检测多只小鼠,具有较大的优越性,但能否取代有创法尚需更多的数据。本研究旨在建立无创检测小鼠气道高反应性的检测方法,并与有创检测方法进行比较。 方法 根据动物模型和气道反应性检测方法不同动物分为 : ① 无创哮喘组 ; ② 无创对照组 ; ③ 有创哮喘组 ; ④ 有创对照组采用卵白蛋白致敏和激发建立 BALB/ c 小鼠哮喘模型,生理盐水作为对照,分别用无创和有创的方法测定气道反应性。 哮喘动物雾化吸入0 . 250 g/ L 倍增浓度的乙酰甲胆碱 ( Mch)测定相应浓度下的增强呼气间歇 ( Pe nh) 值或气道阻力 ( RL ) 值等指标将小鼠吸入 Mc h RL Penh 增加 2 倍的激发浓度以 PC100 来表示所有动物都行支气管肺泡灌洗收集灌洗液涂片染色后分类计数结果 无创哮喘组 PC100 均 ≤6 . 25 g/ L对照组 PC100 均 ≥ 12 . 5 g/ L Lo g2 ( 10 PC100 ) ( 5 . 36 ± 0 . 84) 显著低于对照组 ( 7 . 97 ± 0 . 82)( P < 0 . 01)无创哮喘组从 Mc h 浓度3 . 12 g/ L 开始 Pe nh 值明显高于对照组有创哮喘组 RL 值从Mc h 浓度0 . 39 g/ L开始就明显高于相应对照组 ( P < 0 . 05)无创组与有创组的气道反应性相关系数 R =

0 . 96 ( P < 0 . 01)。 无创哮喘组和有创哮喘组的嗜酸粒细胞分别为 ( 54 . 00 ± 5 . 96) %, ( 55 . 93 ± 5 . 92) %显著高于各自对照组的 ( 0 . 38 ± 0 . 52) %, ( 0 . 63 ± 0 . 74) %( P < 0 . 01)结论 本研究表明以 Penh 为主要测定指标的无创方法,可以成功检测哮喘小鼠气道高反应性。

【关键词】 小鼠 ;气道反应性 ; 支气管哮喘 ;增强呼气间歇 ; 无创检测

Ab st ra ctObjective Most of t he evaluation on asthmatic mouse model only based on the airway inflammation, not fully reflecting its pathophysiology. Noninvasive method of measuring bronchial hyper responsiveness can detect several conscious mice in one time, but whether it can replace the invasive technique needs more data to be identified. This study aims to establish a non-invasive detection of mouse airway hyper responsiveness,comparing with the invasive method. Methods According to different ways of detection, mice were divided into four groups : non-invasive asthma group, non-invasive control group,invasive asthma group and invasive control group . Mouse was sensitized and challenged with ovalbumin ( OVA) for asthmatic model . The mice were challenged with increasing concentrations of methacholine aero sol from 0 . 2 250 g/ L,and the airway resistance was measured. Enhance pause ( Penh) or airway resistance ( RL ) was taken for each group . The dose of methacholine causing 100 % increase of respiratory resistance was defined as PC100 . The PC100 values were converted into Log2 ( 10 PC100 ) for statistical analysis. Bro nchoalveolar lavage cytology was performed to evaluate the airway inflammation. Results The PC100 of non-invasive asthma group was 6 . 25 g/ L, and the non-invasive control groups 12 . 5 g/ L . I t s Lo g2 ( 10 PC100 ) value was significantly less than that of control group, ( 5 . 36 ± 0 . 84) vs ( 7 . 97 ± 0 . 82) ( P < 0 . 01) . The Penh value of non -invasive asthma group began significantly increasing when the concentration of Mch was 3 . 12 g/ L . The RL value of invasive asthma group was increasing at the beginning of 0 . 39 g/ L ( P < 0 . 05) . The coefficient rate of two groups was 0 . 96 ( P < 0 . 01 ) . The EOS ( %) of non-invasive asthma group or invasive asthma group was 54 . 00 ± 5 . 96, 55 . 93 ± 5 . 92 respectively, significantly larger than that of control group ( 0 . 38 ±

0 . 52,0 . 63 ± 0 . 74, P < 0 . 01) . Conclusions This study shows that single-chambered barometric whole-body plethysmography as a non- invasive lung function test can success fully detect airway responsiveness in asthmatic mouse model .

Key words Mice ; Airway hyper responsiveness ; Bronchial asthma ; Enhance pause ; Noninvasive method

从最早的电刺激离体气管平滑肌收缩能力测定,到现在的无创单腔整体体积描计,国外在对动物气道反应性的测定技术上经过了漫长的发展历程而目前国内在对支气管哮喘 ( 简称哮喘) 小鼠的评价上多数仅仅立足于气道炎性指标,在气道反应性的检测方面近几年才起步,而且是用有创的方法。我所率先从国外引进了动物无创检测的肺功能仪。气管插管后再测定动物气道阻力的有创法是评价动物气道反应性的经典方法。无创法则不需气管插管等繁琐的步骤,在动物处于自然状态下就可以直接测定其气道反应性,而且每次可以同时检测多只小鼠,具有较大的优越性,但能否取代有创法尚需更多的数据。 因此,我们有必要探讨其与有创法的相关性,判定其是否能够有效检测动物的气道反应性,以期建立哮喘小鼠气道反应性的无创检测方法。

仪器与试剂

仪器 : 本实验采用小鼠无创肺功能仪和有创肺功能仪,是目前国际上通用的小鼠肺功能检测仪器,主要包括体描箱,压力传感器 ( 流量传感器),信号放大器和雾化器等。 其工作原理是将乙酰甲胆碱 ( met hac holi ne, Mc h) 或生理盐水 ( N S) 等通过雾化器雾化入体描箱内箱内小鼠吸入雾化气体后呼吸运动的改变引起箱内压力 流量产出相应的变化连接于体描箱的压力传感器 ( 流量传感器) 将采集到的信号传至信号处理系统,并在信号放大器作用下转化为呼吸动力学各指标值。 两套肺功能仪中无创肺功能仪具有 6 个体描箱 ( 也有配置更多的)相应的传感器可以将各个箱内压力 流量的变化同步传至信号处理系统处理,因此可以同步为多只小鼠进行肺功能检测。 主要试剂 : 鸡卵白蛋白 ( OVA ) ( Ⅴ 级美国 S i gma 公司)氢氧化铝凝胶 ( 美国 S i g ma 公司), Mc h ( 美国 Si gma 公司)

实验动物及分组

实验动物 : SP F BALB/ c 雌鼠,56 周龄体质量 1820 g,购自广州中医药大学实验动物中心,并在该中心饲养。 饲料为去 OVA ( 不含鸡蛋) 的特殊食物饲养环境符合 SP F 实验动物级环境设施标准分组 : 根据动物模型和气道反应性检测方法不同分为 : ① 无创哮喘组 ; ② 无创对照组 ; ③ 有创哮喘组 ; ④ 有创对照组其中无创哮喘组 有创哮喘组每组 10 只小鼠 ; 无创对照组 、 有创对照组每组 8 只小鼠

哮喘模型的建立方法

实验第 0 天 、 第 7 天和第 14 天行腹腔注射致敏 :模型组每次给予 20μ g OV A + 150μ l Al (O H) 3 + 50 μ l N S( 100 mg/ L ) 混悬液 ; 对照组给予 200 μ l N S实验第 28 天 、 第 29 天和第 30 天行滴鼻激发 ; 模型组每次给予50 μ l OV A2 N S ( 2 g/ L ) 滴鼻对照组给予 50 μ l N S

检测的指标及原理

无创组用体积描记法测定增强呼气间歇 ( e n ha nce d p a u se, Pe n h) 如图 1[ 1 ]所示 : 曲线反映的是体描箱内小鼠呼吸时的压力变化 ; 曲线上部分为呼气相下部分为吸气相 ; 气流受限时曲线的呼气相部分明显延长,呈现阻塞性通气功能障碍时特有的呼气末凹陷,呼气相延长的程度反映了气流受限的程度,定义为呼气间歇( Pa u se),用吸气峰流速 (p ea k i n spi r a t io n p re s s ur e, P I P) 及呼气峰流速 ( p ea k e xpi r at io n p r e s s ur e, P EP) 比将其标准化即得 Pe n h,此参数即可反映气道反应性。 计算公式如图所示 : 其中 Te 代表呼气相时间, Ti 代表吸气相时间, T r 代表呼气相 “ 松弛时间” 即呼气相描记箱内压力衰减为 P EP 36 %所用时间。Penh = P EP/ PIP ×Pa u se有创组测定的是气道阻力 ( RL )

气道反应性的检测

实验第 32 首先连接好 B u xco 无创肺功能仪并定标将自然状态下的 BALB/ c 小鼠置入体描箱中先测定基础 Pe n h ; 随后用 Mc h 激发浓度由低到高依次为 0 0 . 20 0 . 39 0 . 78 1 . 56 3 . 12 6 . 25 12 . 5 25 50 g/ L记录此时的 Pe n h 每次雾化吸入 2 mi n,记录3 mi n。 有创组则是将小鼠行气管插管后用 B u xco 有创肺功能仪测定其 RL

气道炎症

气道反应性检测后行支气管肺泡灌洗 ( PB S 0 . 8 ml × 3 )回收支气管肺泡灌洗液离心细胞沉淀重悬,取部分计算细胞总数,余下部分制备涂片, H E 染色后行细胞分类计数每张涂片计数 400 个细胞记录各种细胞数目

统计学处理

实验结果以 Š x ±s 表示,为进行无创组和有创组气道反应性相关分析, 分别将每个 Mc h 激发浓度下的Pe n h RL 组转换为与 N S 激发的基础值的百分比 ( Mc h 激发的 Pe n h 值或 RL / N S 激发的 Pe n h 值或 RL值 × 100 %) 来表示采用 SPSS 11 . 0统计软件分析两组样本均数进行 t 检验或相关分析, P < 0 . 05 P <0 . 01表示差异有统计学意义

小鼠的气道反应性

小鼠在各浓度级 Mc h 激发下各组 RL 变化各异具体见表 1。Penh 升为基础水平 2 倍时的 Mch 浓度定为 PC 100无创哮喘组 PC 100 均 ≤ 6. 25 g/ L对照组 PC 100 均 ≥ 12. 5 g/ L具体分布见表 2。无创哮喘组 Lo g2( 10 PC100 ) ( 5 . 36 ± 0 . 84) 显著低于对照组 ( 7 . 97 ± 0 . 82) ( P < 0 . 01)

1 各浓度级 Mch 激发下各组的平均气道阻力

组别

Mch ( g/ L)

基线 生理盐水 0 . 20  0 . 39  0 . 78  1 . 56  3 . 12  6 . 25  12 . 50  25 . 00  50 . 00

无创对照组 0 . 48  0 . 45   0 . 46  0 . 49  0 . 45  0 . 52  0 . 52  0 . 54  0 . 77   1 . 39    2 . 03

无创哮喘组 0 . 45  0 . 46   0 . 52  0 . 49  0 . 52  0 . 65  0 . 96  1 . 38  2 . 41   3 . 90    5 . 25

有创对照组 1 . 57  1 . 61   1 . 68  1 . 85  2 . 21  2 . 41  2 . 61  3 . 22  4 . 07   5 . 05    6 . 81

有创哮喘组 1 . 78  1 . 84   2 . 05  3 . 12  3 . 90  4 . 14  5 . 14  5 . 85  7 . 10   8 . 83    11 . 01

: Mch : 乙酰甲胆碱

2 无创哮喘组和无创对照组 PC100 分布

组别

PC100 ( g/ L)

0 . 00  0 . 20  0 . 39  0 . 78  1 . 56  3 . 12  6 . 25  12 . 50  25 . 00   50 . 00

无创哮喘组 ★★  ★★  ★★★★★★

无创对照组 ★★★ ★★★ ★★

: “★ ” 个数表示 PC100 分布数目

用无创方法测得的小鼠气道反应性如图 2 所示其气道反应性是以小鼠在 NS 激发下的 Penh 值为基准取其他各个浓度级 Mch 激发下的 Penh 值与其百分比来反映。 对于用有创方法测得的 R L 值也是用类似的方法转换成比值来表示。 两种方法(无创与有创) 分别测定的模型组与对照组的气道高反应性结果见图 2 、 图 3将无创哮喘组和有创哮喘组的气道反应性相应值行两样本的 t 检验 P > 0. 05。

气道反应性的相关性

将反映无创哮喘组和有创哮喘组气道反应性的 Penh 值和 R L 行相关分析得出其相关系数 R = 0. 96 ( P <0 . 01)见图 4。

气道炎症

见表 3。

3 各实验组肺泡灌洗液细胞涂片的细胞分类

组别 鼠数  嗜酸粒细胞( %)    中性粒细胞( %)   淋巴细胞( %)       巨噬细胞( %)

无创对照组 8     0 . 38 ± 0 . 52 10 . 63 ± 5 . 18 14 . 75 ± 6. 34 74 . 25 ± 5 . 55

无创哮喘组 10     54 . 00 ± 5 . 96a   7 . 25 ± 2 . 39    10 . 43 ± 5. 07      28 . 33 ± 5 . 64

有创对照组 8     0 . 63 ± 0 . 74 12 . 00 ± 4 . 87 14 . 00 ± 4. 10 73 . 37 ± 6 . 84

有创哮喘组 10    55 . 93 ± 5 . 92b    7 . 73 ± 3 . 55     11 . 88 ± 2. 81      24 . 48 ± 7 . 12

:与无创对照组相比,aP < 0 . 01 ;与有创对照组相比,bP < 0 . 01

国外对小鼠气道反应性测定的方法研究颇多。 最早的为电刺激离体气管平滑肌收缩能力测定由于是离体测定故难以反映气道受刺激后黏液分泌和黏膜水肿等情况 ; 又因为标本只是取自大气道,所以不能完全反映小气道病变所引起的肺通气功能障碍。 1967 , Pal ece k [ 1 ]

首次建立体积描记法测定肺阻抗,此方法是通过气管切开和机械通气的方式进行的,因此存在麻醉及手术等影响因素,而且不能对同一动物进行反复检测。 后来,L i ke n s [ 2 ]将此法改进为经口气管插管,实现了重复检测,但对小鼠行经口气管插管则有一定的技术难度。 1979 , Pe n noc k [ 3 ]建立了双室体积描记法,但此法需要限制小鼠活动, 不适进行长期监测。 1997 , Ha mel ma n n [ 4 ]初步建立了无创的单腔整体体积描计法,克服了双室体积描记的不足。该方法是根据哮喘时Te 延长、表现为呼气末暂停时间延长即 Penh来定量反映气流受限程度 Penh 并不是反映 RL 的一个直接指标,目前仍存在不少争议。

目前国内对哮喘小鼠的评价多数仅立足于气道炎性指标,不能完全反映哮喘的病理生理特征。 本实验率先在国内采用单腔的整体体积描计法检测 BALB/ c 小鼠的气道反应性探讨 Pe n h 作为气道反应性无创检测指标的可行性,尝试建立无创高效的气道反应性检测方法。既往已证实,同样方法制作的哮喘模型,以有创检测的方式测得的气道反应性已明确高于对照组[ 5 ],本实验的有创哮喘组与对照组相比也同样证实有明显的气道高反应性。提示本实验建立的无创的气道反应性检测方法可能与既往经典的有创检测方法有一定的相关性。而将反映无创哮喘组和有创哮喘组的气道反应性的 Pe n h 值和 RL 值行相关分析结果非常接近 1 ( P < 0 . 01),证实两种方法密切相关。无创哮喘组从 Mc h 3 . 12 g/ L 开始出现 Pe n h 明显升高而有创哮喘组从0 . 39 g/ L 就开始呈现这样的变化,提示无创方法的敏感性稍低。 这可能与 Mc h 在有创方法中是通过插管直接作用于下气道而在无创法中要经过鼻部等上气道后才作用于下气道有关但是两组反应性差异无统计学意义,说明两种方法测得的反应性相当。此外,在检测小鼠气道反应性过程中,行无创方法的小鼠不必麻醉,而且每次可以同时检测 6 只小鼠动态观察也不受限 ; 这些在有创方法中都无法实现。从气道炎性指标上看,无创哮喘组和有创哮喘组的嗜酸粒细胞明显高于各自的对照组 ( P < 0 . 01)。 而本实验所制作的模型是参照我所于 2006 年已成功制作的哮喘模型[ 5 ], 说明该模型的气道炎性有良好的重复性

综上所述, Penh为主要测定指标的无创肺功能检测方法作为 BALB/ c 雌鼠气道高反应性的检测可行、高效。至于是否能应用于其他品系的检测,还有待论证,有报道Penh 在其他种群中敏感性不一致[ 6 ]。


[ 1 ] Pal ecek F, Palece ko va M, Aviado DM, et al . Emp hyse ma i n i mmat ur e r at s . Co ndit io n p ro duced by t racheal co nst rictio n a nd papai n . Arch

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[ 3 ] Pennock B E, Co x CP, Roger s RM,et al . A no ni nva si ve t echni que f o r mea sure ment of change s i n specific ai r way re si st a nce . J Appl Physiol,

1979,46 : 3992 406 .

[ 4 ] Ha mel ma nn E, Schwa rze J, Ta keda K, et al . No ni nva si ve mea sur ement of ai r way r espo nsi veness i n all er gic mice usi ng ba ro met ric

plet hysmograp hy. Am J Re spi r Crit Ca re Med,1997,156 ( 3 Pt 1) : 7662 775 .

[ 5 ] 何胜东,赖克方,姚卫民,. 小鼠哮喘模型气道反应性检测方法的建立. 广东医学,2006,27 : 16592 1661 .

[ 6 ] Adler A, Cie slewicz G, Ir vi n C G. Unre st rai ned plet hysmo grap hy i s a n unrelia ble mea sure of ai r way re spo nsi vene ss i n Bal b/ c a nd C57BL/ 6

mice . J Appl Physiol,2004,97 : 2862 292 .


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